Візуалізація кальцієвих сигналів
Візуалізація кальцієвих сигналів, також кальцієва візуалізація (від англ. calcium imaging) — спосіб вимірювання концентрації іонів кальцію в клітині чи її частинах за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Клітини розміщаються в полі зору мікроскопа, в них вводиться флуоресцентний барвник, а потім стимулюється вхід кальцію до клітини чи її компартментів. При зв'язуванні іонів кальцію з барвником відбувається випромінення світла, яке реєструється за допомогою сенсора відеокамери. Флуоресцентні барвники поділяються на хімічно синтезовані молекули (Fura, Indo тощо) та кальцій-чутливі білки (наприклад, екворин). Метод кальцієвої візуалізації дозволяє одночасно вимірювати кальцієві сигнали в багатьох клітинах, що дозволяє одразу отримувати велику статистику відповідей та вивчати синхронне поширення кальцієвої хвилі в багатьох пов'язаних клітинах, зокрема в синцитії чи при синхронній активності нейронів.
Дослідження кальцієвих сигналів розпочалося на клітинних культурах. Далі почали використовувати органотипову культуру зі зрізів мозку ссавців. Утім уже наприкінці 1990-х років з'явилися праці з кальцієвої візуалізації в організмах безхребетних та рибки даніо-реріо. Цей результат вдалося отримати за допомогою штучної експресії білка апоекворину, а також заповненню тканин флуоресцентними барвниками Fura-2 та Fluo-3. Подальші удосконалення методики пов'язані з появою двофотонних сканувальних лазерних мікроскопів, що дозволило отримувати зображення в глибоких шарах мозку хребетних тварин[1].
Перші праці з візуалізації кальцієвих сигналів розпочалися в 1970-ті роки, а першим хімічним кальцій-чутливим барвником стала BAPTA[en]. Пізніше були відкриті кальцій-чутливі люмінесцентні білки, першим з яких став екворин, виділений з медузи Aequorea victoria. Також у 1970-ті використовували як індикатори мурексид та арсеназо III, проте їхня чутливість сильно залежала від рівня pH[1].
Похідні BAPTA Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, кальцієвий зелений-1 та Oregon green BAPTA стали популярними сенсорами кальцію. Існують органічні барвники з високою спорідненістю до іонів кальцію для вимірювання цитоплазматичної концентрації та з низькою афінністю — для вимірювання концентрації кальцію в депо[1].
За допомогою генної інженерії були створені білкові кальцієві сенсори.
Існує низка способів доставити барвник у клітини. Зокрема можна працювати з окремими клітинами, групами клітин та з мозком живих тварин.
Першим способом заповнення клітини барвником був внутрішньоклітинний мікроелектрод, яким пробивали клітинну мембрану та вводили речовину до цитоплазми. Далі почали використовувати електроди для петч-клемпу. Іншим способом є спрямована електропорація: мікропіпетка підводиться до клітини, перший електричний імпульс на короткий момент дестабілізує мембрану клітини, роблячи її проникною, а наступні виштовхують заряджені молекули барвника в клітину. Проблема останнього методу — в можливій загибелі досліджуваного нейрона[2] .
Для проникнення барвників крізь мембрану багатьох клітин були розроблені спеціальні ацетилоксіметильовані (AM) форми барвників. При потраплянні до цитоплазми ця група відрізається внутрішньоклітинними естеразами. Інший спосіб потрапляння барвників у нейромережі — створення кон'югатів флуоресцентних зондів з декстранами, які вносять в місця проходження нервів. Кон'югати транспортуються в обох напрямках по аксону нейрона[2].
Також білкові флуоресцентні кальцієві сенсори можна штучно експресувати в клітинах методами трансфекції. Найбільш популярною для нервової системи є вірусна трансфекція[2].
- ↑ а б в Russell J. T. (2011). Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British journal of pharmacology, 163(8), 1605–1625. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2010.00988.x (англ.)
- ↑ а б в Grienberger, C., & Konnerth, A. (2012). Imaging calcium in neurons. Neuron, 73(5), 862—885. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.02.011 (англ.)
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., & Zlatic, M. (2021). Calcium imaging analysis — how far have we come?. F1000Research, 10, 258. https://doi.org/10.12688/f1000research.51755.2 (англ.)