Нокдаун гену
Нокдаун гену – метод в експериментальній біології, завдяки якому досягається постійна або тимчасова зупинка експресії певного гену. Цього можна досягти або шляхом генетичної модифікації організму, або застосуванням певних хімічних сполук, а саме коротких ДНК або РНК (олігонуклеотидів), які зазвичай споріднені до мРНК гену, який потрібно вимкнути.[1]
Якщо нокдаун гену досягнуто завдяки змінам в ДНК організму методами генної інженерії, утворений лабораторний організм зазвичай називають "нокдаун-організмом" (англ. "knockdown organism"). Якщо рівень експресії певного гену тимчасово змінений додаванням олігонуклеотидних реагентів, які діють на мРНК без змін на генному рівні, йдеться про тимчасовий нокдаун (англ. "transient knockdown").[1]
Під час тимчасового нокдауну олігонуклеотидні реагенти зв’язуються або безпосередньо з цільовим геном, або з його мРНК-транскриптом, і врешті-решт впливають на кількість кінцевого продукту експресії цього гену завдяки різним молекулярним механізмам. Такими механізмами є, наприклад, блокування транскрипції, деградація мРНК (завдяки міРНК), блокування сплайсингу і трансляції мРНК тощо.[1][2]
Найбільш важливою галуззю застосування тимчасового нокдауну є вивчення функції нових генів. Для генів із відомою нуклеотидною послідовністю і невідомою функцією тимчасовий нокдаун дає змогу визначити їх роль за змінами, що відбуваються в клітині або організмі. Такий експериментальний підхід отримав назву зворотна генетика. Він особливо популярний в біології розвитку.[3]
РНК-інтерференція дає змогу вимкнути експресію певного гену шляхом деградації мРНК.[4] Нокдаун гену у цьому випадку досягається введенням в клітину малих дволанцюгових інтерферуючих РНК (міРНК). Малі інтерферуючі РНК можуть утворюватись всередині клітини з ендогенних РНК, а можуть бути введені ззовні. Після введення в клітину міРНК сприятимуть деградації цільової мРНК шляхом залучення RISC-комплексу та рибонуклеаз.[5]
РНК-інтерференція широко використовується в біологічних лабораторіях для вивчення функцій генів.[6] РНК-інтерференція в таких модельних організмах як нематода C. elegans і фруктова муха D. melanogaster дозволяє дуже швидко дізнатись, яку саме роль виконує той чи інший ген із відомою нуклеотидною послідовністю. Дослідження функцій генів за допомогою РНК-інтерференції може бути автоматизоване і проводитись паралельно для великої кількості генних послідовностей — так званий РНКі-скринінг).[7][8]
Інший експериментальний підхід до нокдауну генів базується на бактеріальній системі CRISPR.[9] Протеїни, закодовані в CRISPR-асоційованих генах (cas-генах), розпізнають ендогенну ДНК, фрагментують її та зберігають у CRISPR-локусі. Коли кластер CRISPR експресується в клітині, короткі РНК-фрагменти, що врешті утворюються, слугують як матриці для Cas-білків для дезактивації ДНК з ідентичними послідовностями. Ця система, яка в природі є своєрідною імунною системою бактерій, була перенесена біологами в інші організми і перепрограмована для керованих маніпуляцій (розрізання) з ДНК різних організмів. Системи на основі CRISPR були застосовані в людських клітинах,[10] бактеріях,[11] C. elegans,[12] рибах[13] та інших модельних організмах задля маніпуляції з геномами. Системи на основі CRISPR дозволяють отримати широке розмаїття нокдаун-організмів.
Нокдаун-організми були спочатку розроблені для фундаментальних досліджень. Вони особливо цінні у дослідженнях багатоклітинних модельних організмів, таких як миші, коли тимчасовий нокдаун шляхом введення РНК-олігонуклеотидів не може бути ефективно досягнутий.[3][14]
Згодом нокдаун-організми стали комерційно доступними для різних задач, головним чином для медичних досліджень. Наприклад, генетично-модифіковані миші із нокдауном гену-супресору пухлин використовуються в дослідження ракових пухлин.
- ↑ а б в Summerton, J (2007). Morpholino, siRNA, and S-DNA Compared: Impact of Structure and Mechanism of Action on Off-Target Effects and Sequence Specificity. Med Chem. (Pubmed). Т. 7, № 7. с. 651—660. doi:10.2174/156802607780487740. PMID 17430206.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Summerton, J (1999). Morpholino Antisense Oligomers: The Case for an RNase-H Independent Structural Type. Biochimica et Biophysica Acta (Pubmed). Т. 1489, № 1. с. 141—58. doi:10.1016/S0167-4781(99)00150-5. PMID 10807004.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ а б Nasevicius, A; Ekker SC (2000). Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics (Pubmed). Т. 26, № 2. с. 216—20. doi:10.1038/79951. PMID 11017081.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Fire, A (1997). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature (Pubmed). Т. 391, № 6669. с. 806—811. doi:10.1038/35888. PMID 9486653.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Pratt, AJ (2009). The RNA-induced silencing complex: a versatile gene-silencing machine. Journal of Biological Chemistry (Pubmed). Т. 284. с. 17897—901. doi:10.1074/jbc.R900012200. PMC 2709356. PMID 19342379.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка)Обслуговування CS1: Сторінки із непозначеним DOI з безкоштовним доступом (посилання) - ↑ Fraser, AG (2000). Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature (Pubmed). Т. 408, № 6810. с. 325—330. doi:10.1038/35042517. PMID 11099033.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Kamath, RS (2003). Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (Pubmed). Т. 30, № 4. с. 313—321. doi:10.1016/S1046-2023(03)00050-1. PMID 12828945.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Ghadakzadeh, S., Mekhail, M., Aoude, A., Hamdy, R. and Tabrizian, M. (2016), Small Players Ruling the Hard Game: siRNA in Bone Regeneration.
- ↑ Gilbert, LA (2013). CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell (Pubmed). Т. 152, № 2. с. 442—451. doi:10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145. PMID 23849981.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Esvelt, KM (2013). Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods (Pubmed). Т. 10, № 11. с. 1116—1121. doi:10.1038/nmeth.2681. PMC 3844869. PMID 24076762.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Jiang, W (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems (Pubmed). Nature Biotechnology. Т. 31, № 3. с. 233—239. doi:10.1038/nbt.2508. PMC 3748948. PMID 23360965.
- ↑ Chen, C (2013). Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research (Pubmed). Т. 41, № 20. с. e193. doi:10.1093/nar/gkt805. PMID 24013562.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Hisano, Y (2013). Genome editing using artificial site-specific nucleases in zebrafish. Development, growth, and differentiation (Pubmed). Т. 56, № 1. с. 26—33. doi:10.1111/dgd.12094. PMID 24117409.
{{cite news}}:|format=вимагає|url=(довідка) - ↑ Adenoviral Gene Knockdown Cells. Sirion Biotech. Архів оригіналу за 9 липня 2013. Процитовано 17 квітня 2013.